背景：近年来，在先进的早产儿和重症监护病房中盈配网，需要插管和人工通气的新生儿数量不断增加，随之而来的是，因长期插管而并发气管狭窄的儿童数量也在增多，这使得气管手术修复的需求日益增长。本研究旨在评估一种新型组织工程可生物降解膜对封闭较大气管缺损的能力。
材料和方法：使用 NVR - 7 膜（一种由硫酸葡聚糖明胶构建物交联而成的共聚物）修复兔子手术造成的 105mm 气管缺损。这种新型膜的独特特性包括生物相容性、可生物降解性、弹性、可缝合性，以及易于进行灭菌处理。在术后 2 周、3 周、4 周和 8 周对动物实施安乐死并检查气管。
结果：8 只接受气管手术的兔子中有 7 只存活，气管密封良好，气道近乎正常。对取出标本的宏观和微观研究显示，机体对该膜产生了不同程度的免疫原性反应。从长期来看（2 - 3 个月），气管的所有层次都实现了完全再生，模拟了正常气管的原始结构和有序排列。
结论：使用上述膜进行手术矫正，使手术动物能够克服任何呼吸窘迫，有效矫正了诱导的气管缺损。通过这项实验研究，我们得出结论，新型 NVR - 7 膜似乎是治疗气管缺损患者的一种有前景的辅助治疗手段。
一、引言
展开剩余91%使用假体进行气管重建的效果有限，这是由于存在局部感染、吻合口漏、出血、肉芽肿形成、狭窄，以及后期假体移位等问题。这些问题归因于假体的生物相容性差，这促使人们开发出用胶原海绵密封的气管假体，从而提高了生物相容性。随着组织工程三维构建物的引入，再生重建医学迎来了新时代。这些构建物采用培养的软骨细胞（来自鼻子、鼻中隔、气管、骨髓和耳朵）和纤毛上皮细胞，嵌入由聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA）制成的合成、生物相容性和可生物降解的支架中，该支架还含有生长因子和细胞因子。其他天然存在的聚合物，如胶原蛋白和透明质酸，以及由聚氨酯制成的合成材料 DegraPol®（意大利坎图生物工程实验室），都被用作构建复合气管植入物的支架。我们设计了一种灵活、有弹性、可生物降解且高度可缝合的膜，它是一种基本由硫酸葡聚糖和明胶组合而成的交联共聚物构建物，用于修复气管缺损。本研究旨在评估使用这种新型膜进行动物实验的结果。
东莞市富临塑胶有限公司是Degrapol在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供植入级可吸收聚氨酯Degrapol。
二、材料和方法
01.NVR 的组织工程膜
为修复气管缺损，以色列内斯锡安的 NVR 实验室（神经元血管重建实验室）利用组织工程技术，开发出一种可生物降解的交联共聚物构建物。它主要由硫酸葡聚糖和明胶聚合物组合而成，能形成不同可调格式、质地和稠度的各种类型支架（图 1）。我们选择了一种 2 毫米厚、灵活、有弹性且可缝合的膜用于手术矫正，该膜在降解前的保留时间约为 3 - 4 周。
图1：由硫酸葡聚糖和明胶交联共聚物构建物制成的 2 毫米厚、有弹性、可缝合、可生物降解的 NVR - 7 膜切片显微照片。注意 I、II 和 III 三层盈配网，其密度和宽度各不相同。最薄的一层（I）位于内部，最致密的一层（III）位于外部。（A）苏木精和伊红染色（H&E），原始放大倍数 50 倍。 （B）苏木精和伊红染色（H&E），原始放大倍数 100 倍。
02. 动物实验设计
实验方案经过阿萨夫哈罗费医学中心动物实验委员会和外科研究实验室的审查与批准，并且动物的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH；出版物 85 - 23，1985 年修订版）发布的《实验动物饲养和使用指南》。8 只体重 1.5 - 2.0 千克的新西兰白兔在全身麻醉下接受手术。选择兔子模型是因为其气管大小与体重 5 - 6 千克的婴儿相近。通过肌肉注射 35 毫克 / 千克的氯胺酮和 5 毫克 / 千克的甲苯噻嗪实现麻醉。所有动物均进行插管（4 号气管导管）并通气。通过颈部正中切口暴露气管。在气管前中部制造一个标准的 105 毫米缺损，并用 5 - 0 薇乔缝线（聚乙交酯 910）间断缝合（图 2）。气管缺损的长轴方向为纵向。本研究中使用的 NVR - 7 膜比缺损大几毫米，以便在无张力的情况下充分覆盖缺损边缘。通过向手术伤口注射盐水并增加呼吸压力来检测缝合线是否漏气。除 1 只兔子外，所有兔子在麻醉苏醒后均未出现呼吸窘迫，并在 12 小时内开始进食。每天监测临床症状，特别关注体重、咳嗽、咳痰、喘息和呼吸困难情况。
图2：（A）分离出的兔子呼吸系统照片：气管和肺。（B）带有中央缺损（方形）的气管。
03. 组织学检查
在手术后选定的时间点（2 周、3 周、1 个月和 2 个月），每次处死 2 只动物。小心取出整个气管，清除周围软组织，并在近端前缘用缝线标记以进行解剖学识别。标本立即固定在含有 0.5% 十六烷基氯化吡啶（CPC）的 4% 磷酸缓冲甲醛溶液（PBS）中 48 小时，然后在 4% 甲醛中常规固定 1 周。在进一步处理之前，将标本横向切成 2 - 2.5 毫米宽的环。这些环进行脱水处理并包埋在石蜡中。制备 5 微米厚的切片用于组织学和组织化学研究，使用迈耶苏木精和伊红（BDH）（H&E）进行常规显微镜检查，使用 Masson 三色染色法检测结缔组织成分和纤维蛋白，使用阿尔辛蓝检测硫酸化糖胺聚糖（GAGs）和透明质酸。
三、结果
除 1 只动物在拔管后不久因技术故障死亡外，其余所有动物的术后情况均令人满意。1 只兔子在术后 24 小时内出现轻度呼吸窘迫，但此后逐渐好转。动物完全康复，未观察到后期并发症。
01. 气管切片的显微镜检查
术后 2 周，观察到植入膜的残留部分与气管壁相连（图 3）。出现明显的炎症细胞反应，其特征为大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、多核组织细胞、巨噬细胞和巨细胞。多个区域可见栅栏状和异物型肉芽肿形成（图 4 和图 5）。在光学显微镜下，几组类似胶原的纤维束呈现极化现象，这些纤维束很可能是原始共聚物膜（交联硫酸葡聚糖和明胶复合物）的复性明胶丝（图 6）。炎症反应程度随与膜的距离增加而降低。术后 3 周，炎症反应明显减轻。此时，膜的残留部分似乎被成纤维细胞吞噬和包围（图 7 和图 8）。一些被吞噬的膜残留聚集体穿过气管内膜，出现在气管腔内，显示出高度的裂解和分解（图 7 和图 8）。术后 1 个月，上皮和固有层似乎完好无损，部分受损的软骨显示出再生迹象，有成软骨细胞增殖（图 9）。术后 2 个月，软骨和上皮几乎恢复正常，仅有轻微炎症浸润（图 10）。在这个愈合阶段，已经很难确定受伤部位，植入的膜也无法再被识别（图 10）。
图3：术后 2 周 NVR - 7 膜残留部分的显微照片（箭头所示）盈配网，显示其处于高级分解阶段。（A）苏木精和伊红染色，原始放大倍数 100 倍。（B）原始放大倍数 400 倍。
图4：术后 2 周早期炎症反应的显微照片。（A）大量混合炎症细胞浸润围绕异物（箭头）。苏木精和伊红染色（H&E），原始放大倍数 100 倍。（B）异物周围肉芽肿反应的高倍放大图（箭头）。H&E，原始放大倍数 400 倍。
图5：术后 2 周早期炎症反应的显微照片。（A）异物周围的肉芽肿反应（箭头）。苏木精和伊红染色（H&E），原始放大倍数 100 倍。（B）炎症细胞包围异物的高倍放大图（箭头）。H&E，原始放大倍数 400 倍。
图6：术后 2 周 NVR - 7 膜植入部位气管壁偏振光视野显微照片。注意膜残留部分在纵向和横向切片中的丝状光泽（箭头）。苏木精和伊红染色，原始放大倍数 400 倍。
图7：术后 3 周被吞噬的 NVR - 7 膜残留部分向气管腔内迁移。注意对内膜上皮的一些压迫、穿透和瘢痕损伤（箭头），最后可见被吞噬的膜残留部分在气管腔内。苏木精和伊红染色，原始放大倍数 100 倍。
图8：（A）和（B）术后 3 周被吞噬的 NVR - 7 膜残留部分向气管腔内迁移。注意对内膜上皮的一些压迫、穿透和瘢痕损伤（箭头），最后可见被吞噬的膜残留部分在气管腔内。苏木精和伊红染色，原始放大倍数 100 倍。
图9：术后 1 个月气管节段的显微照片，显示透明软骨膜有新软骨形成（小箭头），高度血管化的固有层和完整的上皮。苏木精和伊红染色，原始放大倍数 200 倍。
图10：（A）和（B）术后 2 个月显示 NVR - 7 膜封闭气管缺损过程的显微照片。可见少量炎症成分。软骨和上皮外观完全正常。两张显微照片均用苏木精和伊红染色，原始放大倍数 200 倍。
四、讨论
先天性和后天性气管狭窄仍然是具有挑战性的问题。近年来，需要插管和人工通气的早产儿和重症监护婴儿及儿童数量急剧增加，随之而来的是，因长期插管而并发气管狭窄的儿童数量也相应增加。气管最典型的结构特征是其伸展性非常有限。气管软骨外层的胶原纤维产生的力，以及中央区域水合蛋白聚糖的抗压阻力，阻止了新月形软骨的弯曲。当发生病理过程时，会在阶段性炎症过程的驱动下发生变化和重塑：包括组织细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和巨细胞等多种迁移细胞的侵入，形成纤维性肉芽肿异物反应，以及瘢痕形成。这种修复过程通常无法充分重现原始结构和层次。导致狭窄的一系列事件包括黏膜和软骨的溃疡、伴有肉芽组织的炎症反应、纤维组织形成，以及纤维瘢痕组织的收缩。
毛细血管灌注压是黏膜损伤的关键因素。溃疡愈合涉及上皮再生（一期愈合）或修复（二期愈合）。如果上皮未能覆盖肉芽组织，肉芽组织会过度生长并阻塞气管腔。数周或数月后，肉芽组织会变成几乎无血管的瘢痕，仅含有少量血管。长期插管后，1% - 8% 的新生儿会发生气管狭窄。呼吸困难的症状可能从轻微喘息到严重窒息不等。吸气和呼气时均可听到喘鸣音。手术治疗取决于狭窄的确切位置和程度。基本上有三种治疗方式：内镜治疗，包括直接切除、激光切除（二氧化碳或磷酸钛钾激光）或支架置入；经皮扩张治疗；以及开放手术，包括气管扩张、前环气管劈开术、喉裂开并前腔扩大术、切除术、滑动气管成形术，或端端吻合术。对于广泛的气管狭窄，治疗选择包括各种类型的自体移植补片（使用心包或胫骨前骨膜）、气管支气管支架置入、气管切除术、可扩张金属气道支架置入、球囊导管扩张术，以及蒙哥马利 T 管法。
多年来，人们测试了多种膜材料来修复气管缺损，但结果仅达到中等满意程度。生物膜被认为是最佳选择，它允许纤毛上皮细胞向内重新覆盖，软骨成纤维细胞向外增殖。组织工程试图为细胞提供基础支撑或支架、合适的细胞群体，以及细胞外基质的替代物。细胞与细胞外基质之间的相互作用是细胞迁移、增殖、分化和凋亡的关键因素，而这些对于组织工程构建物来说都是至关重要的功能。本文所述的 NVR - 7 膜似乎是治疗气管缺损患者的一种有前景的辅助治疗手段。
已经制备出内衬呼吸上皮的软骨管并作为气管替代品进行植入。当将气管上皮细胞植入组织工程软骨管上时，3 周时在一些上皮细胞上可观察到纤毛。还需要进一步研究以确定某些细胞外基质成分是否可以最大限度地减少通常观察到的有害免疫反应。用富含透明质酸的混合物 NVR 的 N - gel 覆盖膜，可能有助于获得更好的免疫反应，目前我们实验室正在对此进行试验。下一项研究将使用本文报道的同一种膜，并通过添加内层上皮细胞和外层软骨细胞进行改进。NVR 实验室已经设计出一种环形管形式的完整气管节段作为气管替代品，目前正在开发中，也将成为进一步研究的对象。
五、结论
总之，治疗儿童短段和长段气管狭窄既是可行的，也是值得的。随着先进治疗方法的不断涌现和新的补片材料的开发，治疗效果在不断改善。冷冻保存后的同种异体气管移植手术在动物实验中取得了成功，且无需免疫抑制即可植入。目前，组织工程领域的进展非常迅速，第一个工程化 “气管” 即将成为现实。
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